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CENTRO DE INVESTIGACION DEL CANCER

Unidad de Proteómica

 

En esta Unidad nos esforzamos en proporcionar a los investigadores el acceso a las últimas tecnologías de análisis proteómico. Estas tecnologías son implementadas usando un amplio espectro de técnicas para la separación de péptidos y proteínas, y técnicas basada en espectrometría de masas para caracterizar y cuantificar los analitos de muestras biológicas complejas. Ofrecemos servicios de: a) separación de proteínas, b) identificación de proteínas, c) análisis de modificaciones postraduccionales, d) caracterización de la dinámica proteómica y e) estudios de interacción proteína-proteína. La filosofía de este recurso es dar servicios completos tanto a clientes internos como externos. Proporcionamos asesoramiento técnico sobre el diseño experimental proteómico y realizamos controles de calidad de los procesos.Las propias instalaciones y sus protocolos experimentales han sido certificados según el sistema ISO9001. El Sistema de Gestión de Seguridad y Salud en el Trabajo también está certificada por el sistema OHSAS 18001).

Servicios

• Separación de proteínas por isoelectroenfoque en tiras IPG. La separación de proteínas de acuerdo a su pI se realiza en Ettan IPGphor http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/2d_electrophoresis~2delectrophoresis_handbook
• Separación de proteínas por SDS-PAGE. La separación de proteínas de acuerdo con su peso molecular se realiza en un gel desnaturalizante de SDS-acrylamida:bis-acrilamida http://www5.gelifesciences.com/Aptrix/upp01077.nsf/Content/2d_electrophoresis~2delectrophoresis_handbook
• Separación de proteínas por electroforesis 2D. La separación de proteínas por isoelectroenfoque en tiras IPG es seguida por una separación por SDS-PAGE http://www5.gelifesciences.com/Aptrix/upp01077.nsf/Content/2d_electrophoresis~2delectrophoresis_handbook
• Tinción de geles con Coomassie. Las proteínas separadas en gel se tiñen con azul brillante Coomassie 250 G.
• Tinción de geles con plata. Las proteínas separadas en gel se tiñen con plata mediante una modificación del protocolo de Heukeshoven y Dernick, Electroforesis 6, 103-112, (1988), compatible con espectrometría de masas.
• Fraccionamiento de proteínas o péptidos por IEF en solución. Fraccionamiento de proteínas o péptidos en solución por IEF utilizando el fraccionador de 3100 OFFGEL. http://www.chem.agilent.com/Library/usermanuals/Public/G3100-90001_OFFGEL_UserManual_ebook.pdf
• Fraccionamiento de proteínas o péptidos por HPLC. Fracciona-miento de proteínas o péptidos por filtración de gel, intercambio iónico o cromatografía de fase inversa mediante HPLC 1100.
• Enriquecimiento de fosfopéptidos por IMAC. Los fosfopéptidos son enriquecidos por cromatografía Fe3+ siguiendo el procedimiento SIMAC. Thingholm et al. Molecular & Cellular Proteomics 7:661-671, 2008.
• Enriquecimiento de fosfopéptidos por TiO2. Los fosfopéptidos son enriquecidos por cromatografía TiO2 siguiendo el procedi-miento SIMAC.• Digestión de proteínas en gel. Digestión con tripsina de un spot o banda proteica de un gel. Schevchenko et al. Anal. Chem. 1996, 68, 850-858
.• Digestión de proteínas en solución. Digestión con tripsina de una muestra de proteínas en solución.
• Desalinización y concentración del digestiones de péptidos por C18. Muestras sucias o con baja abundancia de péptidos son limpiadas y concentradas mediante columnas de fase inversa C18 antes de su análisis por MS. Rappsilber J, Anal Chem 2003 Feb 1; 3:663-70.
• Análisis de huella peptídica por MALDI-TOF MS. Identificación de una proteína por análisis de su huella peptídica. Las masas de los péptidos generados por digestión tríptica de una proteína única son analizados por un espectrómetro de masas MALDI-TOF. El patrón de masas obtenido se compara con el patrón de masas de cada proteína en una base de datos del mismo orga-nismo digerida “in silico” con la misma endoproteasa. Pappin et al. Current Biol. 1993, 3, 327-332.
• Análisis por LC-MS/MS de muestras proteicas de baja, mediana o alta complejidad. Los péptidos derivados de la digestión de mezclas proteicas son separados por cromatografía de fase inversa utilizando un nanoUPLC acoplado al espectrómetro de masas. Dependiendo de la complejidad de la muestra de proteínas se utilizan diferentes longitudes de gradiente. Los péptidos eluidos son analizados directamente por MS/MS en el LTQ-Orbitrap velos. Olsen et al. Mol Cell Proteomics. 2009 Dec;8(12):2759-69.
• Análisis Bioinformático – Identificación de modificaciones postraduccio-nales. – Proteómica diferencial. – Secuenciación “De novo”.
• Análisis de peso molecular de proteínas o pépti-dos por MALDI-TOF. Análisis de peso molecular de proteínas o péptidos purificados por MALDI-TOF.• Análisis de la interacción de proteínas por SPR. Análisis de la interacción de proteínas por BIACO-RE X.
• Cuantificación de nucleótidos por HPLC.

Equipamiento

• Electroforesis 2D
• Ettan IPGphor (Amersham,, GE Healthcare).
• Ettan Dalt-6 Electrophoresis system (Amersham). Hoefer miniVE electrophoresis (Amersham)
• Hoefer SE 600 Ruby(Amersham).Adquisición de imagen
• Escáner Epson perfection 1640SU (Proteineersp, Bruker).
• Escáner FLA-3000 Series, (Filtros: Y520, O580, R675Laser: 473nm, 633nm) (Fujifilm).Robots de recogida de spots y digestión de muestras
• Proteineersp, SPOTPICKER (Bruker).
• Proteineerdp, DIGESTOR (Bruker).HPLC
• HPLC1100 (Agilent).• Surveyor LC pump (ThermoFinnigan) coupled with the LCQ-DECA XP.
• NanoAcquity UPLC (Waters) coupled with the LTQ Orbitrap velos.
IEF en solución
• 3100 OFF GEL fractionator (Agilent).Espectrómetros de masas
• MALDI-TOF (Bruker).
• LCQ-DECA XP (ThermoFinnigan).
• LTQ-Orbitrap velos with ETD (ThermoScientific).Interacción de proteínas
• Biacore X (Biacore, GE Healthcare).OtrosLos servicios de esta Unidad y el programa completo de servicios del Programa de Genómica/Proteómi-ca/Bioinformática de la Red Española de Grupos del Cáncer puede ser encontrado en: http://www.rticc.org/index.php?n1=15I

 

Coordinador científico

Xosé R. Bustelo 

Tel.: 923 294 802E-mail: xbustelo@usal.es

Dirección y contacto

Unidad de Proteómica

Centro de Investigación del Cáncer(CSIC-Universidad de Salamanca)

Campus Universitario Miguel de Unamuno s/n E-

37007 Salamanca (ESPAÑA)

Nieves Ibarrola de AndrésTel.: 923 294 720 Ext 1904E-mail: nibarrola@usal.es